lentiCRISPR系统载体改良及GeCKO文库用于功能基因组文库筛选

【背景】

在人类和小鼠细胞中CRISPR-Cas9全基因组文库已经替代了RNAi技术,成为一种新的筛选方式,并且这种技术在多种生物模型中被用于揭示新的机制。但是最初的由病毒包装的CRISPR全基因组敲除(GeCKO)文库病毒效价较低或者需要细胞系表达Cas9,限制了生物系统适合筛选的范围。因此,改良CRISPR载体系统及GeCKO文库对于生物全基因组功能筛选的应用具有重要的意义。本文提供了改良载体和GeCKO文库的多种方法,并进行的严密的验证,得到了改良的双质粒系统以及高覆盖率和高灵活度的GeCKO文库。

【方法】

  1. 构建了新的lentiCRISPRV2系统:去除了传统的lentiCRISPRV1NLS序列,对剩余的NLS序列和P2A顺反子序列进行密码子优化并对U6启动子位置进行调整;
  2. 构建了双载体系统,分别表达Cas9和sgRNA的lentiCas9-Blast和lentiGuide-Puro(图1);
  3. 单质粒载体系统和双质粒载体系统的构建

  4. 改良GeCKO文库:在特异性分析的基础上提高脱靶分数从而降低脱靶效率,突变pre-miRNA的发卡结构来抑制miRNA在转录过程中的作用,增加了1,000个基因的sgRNA;
  5. 改良GeCKO文库分成两个亚文库,每个亚文库包括3个sgRNA和1,000个对照sgRNA。

【结论】

  1. 单载体的lentiCRISPRV2系统比lentiCRISPRV1的病毒滴度高10倍;双载体的lentiGuide-Puro系统比lentiCRISPRV1高100倍(图2);
  2. 结合的亚文库对全基因组进行筛选可以提高文库覆盖率,而单个亚文库可以针对细胞数量较少的全基因组进行筛选,如原代细胞、体内扫描等。这种亚文库可以针对细胞数目的多少,更灵活的对细胞的全基因组进行筛选。
  3. 不同的载体系统病毒滴度比较

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参考文献

  1. Sanjana, N.E., O. Shalem and F. Zhang, Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nat Methods, 2014. 11(8): p. 783-4.