CRISPR-Cas9系统是存在于细菌中的一种天然的免疫系统,每当有病毒入侵时,即可对外源基因组进行编辑,起到保护细菌细胞的免疫功能。基于CRISPR-Cas9强大的基因组编辑能力,科研人员将细菌天然的免疫系统改造成一种可在实验室中广泛使用的基因编辑工具,也是继ZFN和TALEN之后的第三代基因编辑工具。

CRISPR-Platform

CRISPR-Cas9的广泛应用

  1. 基因敲除(Knock-out)
  2. Cas9可以对靶基因组进行剪切,形成DNA的双链断裂。在通常情况下,细胞会采用高效的非同源末端连接方式(NHEJ)对断裂的DNA进行修复。但是,在修复过程中通常会发生碱基插入或缺失的错配现象,造成移码突变,使靶标基因失去功能,从而实现基因敲除。为了提高CRISPR系统的特异性,可将Cas9的一个结构域进行突变,形成只能对DNA单链进行切割造成DNA缺口的Cas9 nickase核酸酶。因此想要形成双链断裂的效果可以设计两条sgRNA序列,分别靶向DNA互补的两条链,这样两条sgRNA特异性的结合靶标序列,即可形成DNA断裂,并在修复过程中通过移码突变实现基因敲除

  3. 基因敲入(Knock-in)
  4. 当DNA双链断裂后,如果有DNA修复模板进入到细胞中,基因组断裂部分会依据修复模板进行同源重组修复(HDR),从而实现基因敲入。修复模板由需要导入的目标基因和靶序列上下游的同源性序列(同源臂)组成,同源臂的长度和位置由编辑序列的大小决定。DNA修复模板可以是线性/双链脱氧核苷酸链,也可以是双链DNA质粒。HDR修复模式在细胞中发生率较低,通常小于10%。为了增加基因敲入的成功率,目前有很多科学家致力于提高HDR效率,将编辑的细胞同步至HDR最活跃的细胞分裂时期,促进修复方式以HDR进行;或者利用化学方法抑制基因进行NHEJ,提高HDR的效率

  5. 基因抑制、基因激活(Repression or Activation)
  6. Cas9的特点是能够自主结合和切割目的基因,通过点突变的方式使Cas9的两个结构域RuvC-和HNH-失去活性,形成的dCas9只能在sgRNA的介导下结合靶基因,而不具备剪切DNA的功能。因此,将dCas9结合到基因的转录起始位点,可以阻断转录的开始,从而抑制基因表达;将dCas9结合到基因的启动子区域也可以结合转录抑制/活化物,使下游靶基因转录受到抑制或激活。因此dCas9与Cas9、Cas9 nickase的不同之处在于,dCas9造成的激活或者抑制是可逆的,并不会对基因组DNA造成永久性的改变。

  7. 多重编辑(Multiplex Editing)
  8. 将多个sgRNA质粒转入到细胞中,可同时对多个基因进行编辑,具有基因组功能筛选作用。多重编辑的应用包括:使用双Cas9nickases提高基因敲除的准确率、大范围的基因组缺失及同时编辑不同的基因。通常情况下,一个质粒上可以构建2~7个不同的sgRNA进行多重CRISPR基因编辑。

  9. 功能基因组筛选
  10. 利用CRISPR-Cas9进行基因编辑可以产生大量的基因突变细胞,因此利用这些突变细胞可以确认表型的变化是否是由基因或者遗传因素导致的。基因组筛选的传统方法是shRNA技术,但是shRNA有其局限性:具有很高的脱靶效应以及无法抑制全部基因而形成假阴性的结果。CRISRP-Cas9系统的基因组筛选功能具有高特异性和不可逆性的优势,在基因组筛选中得到了广泛的应用。目前CRISPR的基因组筛选功能应用于筛选对表型有调节作用的相关基因,如对化疗药物或者毒素产生抑制的基因、影响肿瘤迁移的基因以及构建病毒筛选文库对潜在基因进行大范围筛选等。

 

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