根据靶基因可以设计多对gRNA，不同的gRNA介导的Cas9对DNA的切割效率不一致，因此在利用CRISPR-Cas9建立基因敲除或敲入动物前需要先对gRNA进行活性验证，选取能够介导更高切割效率的gRNA。泓迅科技可以提供三种gRNA活性检测方法: SSA活性检测、体外切割活性验证和内源性活性切割。

SSA活性检测

单链复性(Single-strand annealing，SSA)检测，可以验证打靶质粒是否具有切割裸露DNA的能力，是初步评估CRISPR-Cas9系统有活性的一种常用的方法。在SSA报道质粒中含有两个不具有活性的荧光素酶(luciferase)编码片段，在两者中间含有一个终止密码子和一段gRNA的靶序列。当CRISPR-Cas9能对靶序列进行有效切割形成DNA双链断裂(Double strand breaks，DSBs)，细胞通过SSA机制对DNA序列进行同源重组修复，从而重新形成有活性的荧光素酶基因，之后通过荧光检测就可以预测CRISPR-Cas9的切割活性。

体外切割活性验证

CRISPR-Cas9系统的剪切活性与sgRNA靶点识别序列相关。每个sgRNA靶点识别不同，剪切活性也有所差异，因此需要筛选出切割效率最高的sgRNA。体外检测sgRNA活性检测：使用Cas9体外酶切靶点DNA序列，获得的两条DNA片段。通过琼脂糖电泳分析，观察gRNA介导的DNA被切割的百分比，从而判断gRNA的活性和切割效率。

内源活性检测

Surveyor 法即错配内切酶检测法，采用T7E1内切酶。在靶点两侧设计合适的引物，PCR扩增出含有错配突变位点的DNA条带。T7E1内切酶可以识别并切割错配的杂合DNA双链。将酶切产物通过琼脂糖电泳分析可以初度估计切割条带与未切割条带的比例，从而反应出CRISPR-Cas9的活性。

活性检测服务内容详情：

服务名称 产品/服务内容 交付周期 交付项目 价格
SSA活性检测 1.gRNA靶点引物设计与合成
2.pSSA-luc载体构建
3.细胞转染		 咨询 检测报告 咨询
体外切割活性验证 1.体外转录gRNA
2.CRISPR-Cas9体外酶切反应		 咨询 检测报告 咨询
内源活性检测 1.基因组提取
2.靶点引物设计
3.T7E1酶切反应		 咨询 检测报告 咨询

 

不同活性检测服务项目区别：

服务项目 区别
SSA活性检测 设计简单、操作容易、经济有效。
体外切割活性检测 只需靶点设计，即可进行验证；无需细胞平台支持，EP管内就能实现，成本较低廉。
内源活性检测 筛选周期短，可加快验证流程。

 

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