基因敲除方法筛选与人类肿瘤生长和抗药性相关的基因

【背景】

目前,RNAi技术是筛选哺乳动物细胞基因组功能缺失的一种主要方法。但是RNAi技术只能通过降解mRNA的方法达到抑制基因表达的效果,无法在基因组水平通过敲除基因造成功能缺失。CRISPR-Cas9技术通过sgRNA介导Cas9蛋白,对哺乳动物基因组的特定位点产生插入/缺失的突变,造成其基因功能永久性缺失,有较好的抑制效果。因此构建慢病毒包装的CRISPR-Cas9的高通量筛选文库可以实现基因组范围内的大规模功能基因的筛选。CRISPR-Cas9高通量筛选文库可广泛应用于人类肿瘤疾病研究中,系统的分析、验证一些与肿瘤生长及抗药性相关基因,筛选与肿瘤疾病治疗相关的药物靶点。

【方法】

  1. 构建单质粒载体(图1),载体包含了Cas9基因、sgRNA基因以及Puro筛选标记,使用慢病毒包装转染细胞(图2);
  2. 慢病毒包装单质粒表达载体

  3. 针对人类基因组中18,080个基因的5’外显子,平均每个基因设计3~4个sgRNA位点,构建含有64,751个sgRNA的文库(图2);
  4. sgRNA文库构建及慢病毒包装

  5. 为了检测GeCKO文库的敲除效果,采用阴性筛选检测与细胞耐药性相关的基因;采用阳性筛选检测与细胞生长或生存相关的基因。
    高通量筛选结果的后期分析采用RIGER算法(图3)。
  6. CRISPR基因敲除文库筛选及收集、分析具有筛选表型的细胞

【结论】

  1. 阴性筛选结果显示,GeCKO文库筛选到某些与核糖体结构组成的相关的基因对黑色素瘤A375细胞的生长具有重要的作用;
  2. 阳性筛选结果显示,除了已知的NF1和MED12基因,NF2、CUL3、TADA1和TADA2B这4个基因也参与了威罗菲尼在黑色素瘤A375细胞中的耐药调节过程。

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参考文献

  1. Shalem, O., et al., Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science, 2014. 343(6166): p. 84-7