利用CRISPRi技术调控基因表达

【背景】

CRISPRi技术是在CRISPR-Cas9基础上，将Cas9蛋白改造成为不具有切割活性的dCas9，在sgRNA的介导下仍可以靶向基因组序列。CRISPRi技术能够有效的抑制编码基因和非编码基因的表达，并可同时对多个基因进行调控且无脱靶率。CRISPRi技术的出现为研究基因的功能提供了高效的新方法。

【方法】

设计dCas9结构包括两个突变体RuvC1-和HNH-。sgRNA包含三个部分：20nt用于与匹配目标序列，42nt用于与Cas9结合，40nt为转录终止结构。针对mRFP基因编码序列不同区域设计sgRNA，用于检测dCas9能否高效抑制基因表达。

【结论】

  1. CRISPRi技术能够抑制转录起始和延伸，靶向非模板链DNA的dCas9-sgRNA会产生有效的沉默；靶向模板链DNA的dCas9-sgRNA效果不明显，dCas9-sgRNA结构靶向启动子区域能够造成有效的基因沉默；
  2. CRISPRi基因抑制过程是可逆的。 dCas9-NT1受 aTc启动子控制，随着时间的延长，mRFP蛋白荧光量先降后升，最后会恢复到与阳性对照相同的水平，由此说明CRISPRi基因敲除是一个可逆的过程；
  3. 在目标位点上游转录暂停，暂停位点与目标位点之间长度为19bp碱基，由此得知CRISPRi通过抑制转录过程对基因表达进行调节；
  4. CRISPRi sgRNA沉默是高特异性的，对全基因组范围内的mRNA序列测序得知，sgRNA（NT1）靶向mRFP基因后，mRFP基因是唯一转录丰度降低的基因，没有其他基因显示出明显的基因表达量的变化；
  5. CRISPRi能够同时调节多个基因，设计两个sgRNA分别靶向mRFP基因和sfGFP基因，CRISPRi系统可将两个基因同时敲除，由此说明CRISPRi系统可以同时对多基因进行调节；
  6. 决定CRISPRi沉默效率的因素：sgRNA长度、与目标序列的重合度以及sgRNA的位置CRISPRi抑制的效果与目标位点与起始位点之间的距离呈反比例相关，一般情况下，sgRNA与基因组序列有20bp重复序列用于靶向目标序列，而通过实验数据可以得知基因沉默所需匹配序列的最短长度是12bp；sgRNA的最初7nt碱基区域对于基因沉默具有重要作用；使用两个sgRNA靶向同一个基因，可以提高CRISPRi的效率，但是，如果两个sgRNA具有重叠效应时，可能会降低CRISPRi的效率；
  7. CRISPRi技术可应用于内源性的基因网络。针对大肠杆菌乳糖表达途径上的相关基因设计sgRNA，结果可以得知，LacZ基因的表达量受到抑制，而LacI基因则被激活，表达量有所增加。由此说明CRISPRi技术可以提供一个快速、有效的方法来验证基因网络中各个基因的功能；
  8. CRISPRi技术在人类细胞中也同样适用，可对人类HEK293细胞系中的基因表达造成抑制。

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参考文献
Qi, L.S., et al., Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell, 2013. 152(5): p. 1173-83.