利用CRISPRi技术调控基因表达

【背景】

CRISPRi技术是在CRISPR-Cas9基础上,将Cas9蛋白改造成为不具有切割活性的dCas9,在sgRNA的介导下仍可以靶向基因组序列。CRISPRi技术能够有效的抑制编码基因和非编码基因的表达,并可同时对多个基因进行调控且无脱靶率。CRISPRi技术的出现为研究基因的功能提供了高效的新方法。

【方法】

设计dCas9结构包括两个突变体RuvC1-和HNH-。sgRNA包含三个部分:20nt用于与匹配目标序列,42nt用于与Cas9结合,40nt为转录终止结构。针对mRFP基因编码序列不同区域设计sgRNA,用于检测dCas9能否高效抑制基因表达。

dCas9与sgRNA设计方案

【结论】

  1. CRISPRi技术能够抑制转录起始和延伸,靶向非模板链DNA的dCas9-sgRNA会产生有效的沉默;靶向模板链DNA的dCas9-sgRNA效果不明显,dCas9-sgRNA结构靶向启动子区域能够造成有效的基因沉默(图1);
  2. CRISPRi抑制转录延伸过程

  3. CRISPRi基因抑制过程是可逆的。 dCas9-NT1受 aTc启动子控制,随着时间的延长,mRFP蛋白荧光量先降后升,最后会恢复到与阳性对照相同的水平(图2),由此说明CRISPRi基因敲除是一个可逆的过程;
  4. CRISPRi基因抑制表达过程

  5. 在目标位点上游转录暂停,暂停位点与目标位点之间长度为19bp碱基,由此得知CRISPRi通过抑制转录过程对基因表达进行调节(图3);
  6. CRIPSRi作用于转录延伸过程

  7. CRISPRi sgRNA沉默是高特异性的,对全基因组范围内的mRNA序列测序得知,sgRNA(NT1)靶向mRFP基因后,mRFP基因是唯一转录丰度降低的基因,没有其他基因显示出明显的基因表达量的变化(图4);
  8. CRISPRi sgRNA的沉默是高特异性

  9. CRISPRi能够同时调节多个基因,设计两个sgRNA分别靶向mRFP基因和sfGFP基因,CRISPRi系统可将两个基因同时敲除,由此说明CRISPRi系统可以同时对多基因进行调节(图5);
  10. CRISPRi同时对多个基因调节

  11. 决定CRISPRi沉默效率的因素:sgRNA长度、与目标序列的重合度以及sgRNA的位置CRISPRi抑制的效果与目标位点与起始位点之间的距离呈反比例相关(图6),一般情况下,sgRNA与基因组序列有20bp重复序列用于靶向目标序列,而通过实验数据可以得知基因沉默所需匹配序列的最短长度是12bp(图7);sgRNA的最初7nt碱基区域对于基因沉默具有重要作用(图8);使用两个sgRNA靶向同一个基因,可以提高CRISPRi的效率,但是,如果两个sgRNA具有重叠效应时,可能会降低CRISPRi的效率(图9);
  12. sgRNA与目标基因组的匹配程度
    单sgRNA与双重sgRNA靶向目标基因的效果

  13. CRISPRi技术可应用于内源性的基因网络。针对大肠杆菌乳糖表达途径上的相关基因设计sgRNA,结果可以得知,LacZ基因的表达量受到抑制,而LacI基因则被激活,表达量有所增加(图10)。由此说明CRISPRi技术可以提供一个快速、有效的方法来验证基因网络中各个基因的功能;
  14. 大肠杆菌乳糖管理途径上的相关基因表达量

  15. CRISPRi技术在人类细胞中也同样适用,可对人类HEK293细胞系中的基因表达造成抑制(图11)。
  16. CRISPRi使人类HEK293细胞内荧光表达量降低

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参考文献
Qi, L.S., et al., Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell, 2013. 152(5): p. 1173-83.