由dCas9介导的高效的转录激活系统
【背景】

CRISPR-Cas9技术可以准确、高效的对基因组特定靶位点进行基因编辑,造成基因的缺失或者插入。不具有切割活性的dCas9仍然可以在sgRNA的介导下准确的靶向基因组DNA,因此设计将dCas9与转录增强子进行融合,期望得到的融合蛋白可对基因转录具有增效的效果。这种方法为研究基因的转录激活调控提供了新的方法。

【方法】

dCas9载体构建方案,后续可融合转录激活因子促进转录的进行(图1)。
dCas9载体构建

【结论】

  1. dCas9与转录激活因子融合转录增强结果显示,融合三个转录激活因子的增强的效果明显高于融合单个转录激活因子(图2);
  2. 融合转录激活因子后的表达情况

  3. 为了确定VPR组成的必要性,将三个转录因子中的不同部分用mcherry替换。结果显示,被mcherry替换后的转录增强效果不明显(图3),由此说明VRP结构组成对于转录激活具有重要作用;
  4. VPR结构组成对增强效果的影响

  5. VPR连接顺序是转录激活的影响因子,当顺序为VP64-p65-Rta时,转录激活效果最明显(图4);
  6. VPR的连接顺序对增强效果的影响

  7. 检测人类293T细胞中的MIAT、NEUROD1、ASCL1、RHOXF2、TTN、ACTC1基因,结果显示dCas9结合转录增强子对不同的基因激活程度不同(图5);
  8. dCas9结合转录增强子对不同的基因的增强效果

  9. dCas9-VPR在不同的物种中转录激活效应有所差别,从7倍到 32,600倍的激活效应(图6)。
  10. dCas9-VPR在不同的物种中的转录激活效应

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参考文献
Chavez, A., et al., Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nat Methods, 2015. 12(4): p. 326-8.