使用no-SCAR系统完成大肠杆菌的基因组编辑

【背景】

CRISPR-Cas9作为一种应用广泛的基因组编辑技术可对各物种的基因组进行高效、准确的修饰。Cas9核酸内切酶可以造成DNA双链断裂,通过同源重组和非同源末端连接两种途径对基因组进行修复,实现基因组碱基的缺失或插入,最终完成精准的基因修饰。在大肠杆菌细胞中需要λ-Red系统完成断裂基因组的修复,因此no-SCAR(Scarless Cas9 Assisted Recombineering)系统使用λ-Red方法促进基因组重组外源DNA和Cas9介导的双链DNA切割对野生型细胞进行选择,同时质粒系统无需染色体标记。这种no-SCAR系统可以对基因组的多个位点进行点突变、基因删除和短序列的插入,能够高效、无痕的一步完成,为微生物基因组研究提供了快速、有效的方法。

【方法】

Cas9质粒系统包含PTET启动子,控制Cas9基因表达的ssrA标签和增加负调节表达的tetR启动子,可以严格控制Cas9质粒的转录。sgRNA质粒系统包含gam、bet、exo基因,这些基因表达的λ-Red重组系统可以帮助大肠杆菌基因组进行重组。两个质粒系统包含基因组修饰所需的所有元件,无宿主特异性(图1)。

Cas9及sgRNA质粒系统组成

【结论】

  1. 构建的Cas9和sgRNA表达质粒包含了大肠杆菌基因组修饰的所有元件,无宿主特异性,可对基因组任何位点进行点突变、基因组敲除/敲入;
  2. ropB基因516位点的错义点突变对利福平药物产生抗药性(图2);
  3. RopB基因位点突变序列

  4. 利用71bp长度的引物成功删除了ack基因的1,095bp长度的序列(图3)
  5. ack基因删除序列

  6. 在pfkA基因中成功插入79bp长度的ssA标签(图4);
  7. pfkA基因插入序列

  8. 将细胞分别在基本培养基和无氯霉素培养基上37℃过夜培养后,克隆细胞只在基本培养基上生长。由此说明,no-SCAR质粒可以在基因组编辑完成后被移除,不会对后续基因组编辑操作造成影响。

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参考文献

Reisch, C.R. and K.L. Prather, The no-SCAR (Scarless Cas9 Assisted Recombineering) system for genome editing in Escherichia coli. Sci Rep, 2015(5) :p. 15096.