CRISPR-Cas系统在模式植物和农作物中靶向编辑的应用

【背景】

近年来,基于细菌CRISPR-CasⅡ型的出现,几乎可以替代传统的基因工程,CRISPR-Cas系统允许个性化的小的非编码RNA来介导靶标基因组DNA的切割,从而使基因能够通过非同源末端结合和同源连接的修复机制来修饰基因。该系统基于Cas9核酸酶和靶向核酸序列引导的sgRNA, 只需要单个RNA来产生靶标特异性,CRISPR-Cas系统比ZFNs和TALENs更易应用于基因工程,目前有许多关于CRISPR-Cas9系统在植物基因组编辑中的成功报道[1-8]

【方法】

  1. CRISPR-Cas9技术已成功应用于模型植物(本氏烟草、拟南芥)和作物(稻、小麦)(图1);
  2. 植物基因组编辑流程

  3. CRISPR-Cas系统应用于植物的基因编辑实验
  4. 对植物基因组进行编辑可以使用两个sgRNA对同一基因两个位点进行靶定,造成两个DNA双链断裂,从而造成基因组大片段缺失。将sgRNA-Cas9载体转入到植物细胞中通常采用原生质体转化和农杆菌渗透(采用农杆菌AGL1型)的方法(图2)。
    敲除烟草PDS基因及AFLP分析

【结论】

  1. 经过验证,CRIPSR-Cas9在植物中可以进行有效的基因编辑(图3)。目前已经报道的经过CRISPR-Cas9系统编辑过的植物比例非常高(对于拟南芥高达89%,水稻高达92%)。科学家们也对Cas9的载体构建进行相应的优化,添加标签或者选择在不同的物种中选择合适的启动子;
  2. Cas9载体优化方案

  3. 在植物中,通常使用植物RNA聚合酶III启动子(例如U6和U3)表达sgRNA,这些启动子具有确定的转录起始核苷酸,U6和U3,转录起始的核苷酸在分别是G和A(图4)。
  4. sgRNA载体构建

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参考文献

Belhaj, K., et al., Plant genome editing made easy: targeted mutagenesis in model and crop plants using the CRISPR/Cas system. Plant Methods, 2013.9(1): p. 39.