使用CRISPR-Cas9技术对人类T细胞进行编辑

【背景】

T细胞作为人体重要的免疫细胞，对人体的免疫调节起到重要的作用，如果能够对T细胞的基因组成功进行编辑，那么对癌症、HIV、免疫缺陷疾病和自身免疫病治疗则可以从细胞水平进行治疗。目前，CRISPR-Cas9基因编辑技术可以对多种细胞类型的基因组进行编辑，但是对于人类的T细胞还有一定难度，尤其是对T细胞的基因组进行替换性的基因修饰。本文通过优化CRISPR-Cas9技术，预先将Cas9蛋白与sgRNA在体外组装成Cas9 RNPs，再将Cas9 RNPs转入到细胞中对基因组进行敲除/敲入。本文成功地完成了对人类CD4+ T细胞中的HIV病毒的共同受体CXCR4蛋白和免疫抑制蛋白PD-1的基因靶点的编辑，经过精确编辑后的人体CD4+ T细胞数量得到增加，因此有望于应用于人体的免疫治疗中。这种基于CRISPR RNPs的基因治疗方法，可以人为的对天然的T细胞进行特异性改造，为肿瘤、免疫疾病等多种人类重大疾病的治疗带了新的方法和思路。

【方法】

  1. 使用电穿孔的方法将Cas9 RNPs导入到细胞内，敲除人类CD4+ T细胞表面CXCR4基因的外显子区域；
  2. 针对CXCR4基因设计单链DNA模板用于同源重组修复，替换原序列中的12个碱基，并加入Hind III酶切位点用于验证目标序列是否替换成功；
  3. 针对PD-1基因的第一个外显子设计单链DNA模板，替换原序列的12个碱基，并引入了Hind III酶切位点用于后续验证。

【结论】

  1. 经过T7E1方法确定Cas9 RNPs可以成功编辑T细胞基因组中的CXCR4基因，从而也对人类CD4+ T细胞中的蛋白表达造成影响。同时，流式细胞仪能够丰富被编辑过的T细胞的数量，为Cas9 RNP应用于T细胞提供一种有效的工具；
  2. 经过Hind III酶验证方法得知，基因敲入的目标序列被Hind III酶切割形成2条新的短序列，由此说明Cas9 RNPs结合HDR模板可以精确地对人类T细胞中CXCR4基因和PD-1基因进行替换性的基因修饰；
  3. 通过体外组装Cas9 RNPs可以实现对人类CD4+ T细胞有效的基因组编辑，包括对人类CD4+T细胞中CXCR4和PD-1的基因修饰。

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参考文献

  1. Schumann, K., et al., Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. Proc Natl Acad Sci U S A, 2015. 112(33): p. 10437-42.