PCR克隆是一种放大扩增特定DNA片段的分子生物学技术，在分子生物学和相关领域得到广泛应用。其中PCR克隆引物是PCR扩增反应过程中重要的影响因素。因此，在正式开始PCR克隆实验之前，掌握正确的PCR克隆引物设计方法是一项必要的技能。

PCR克隆引物设计流程：

1. 获取PCR扩增片段序列：第一种情况根据已知片段进行扩增，需要通过NCBI查找基因序列设计PCR扩增引物；另外一种情况是扩增未知基因片段，则需要查找相关物种的保守序列，根据保守序列的DNA或者RNA为模板设计引物。
2. PCR克隆引物设计:引物设计可以通过引物设计软件或者在线工具来完成。例如Primer premier 5.0引物设计软件功能强且使用方便，可以对引物的特异性进行比对并进行综合评价，是引物设计最常用的软件之一。
3. PCR扩增试验验证：引物合成完成之后可进行PCR扩增，根据凝胶电泳扩增产物长度预判PCR克隆引物的正确性。

PCR克隆引物设计注意事项：

1. 引物长度基本保持在18-24bp之间。如果引物序列长度过短，那么可能扩增特异性较低，影响PCR克隆扩增速率；如果引物长度过长，不仅无法提高引物特异性，反而会因为过长的序列造成错配，降低PCR克隆扩增速率。
2. 引物中的GC含量会影响到PCR克隆过程中寡核苷酸的解链温度，即Tm值。Tm值55-80℃为宜，上下游引物间退火温度差异在10℃之内为宜。所以，通常引物中GC含量在40%-60%之间，上下游引物间的GC含量差异在20%之内，可以提高引物的特异性。
3. 避免引物序列中出现重复结构域或与模板序列有较高的相似度。如果出现这种情况，在PCR克隆的过程中可能会造成错配现象的出现，影响PCR扩增的准确性。
4. 避免扩增引物的单链在PCR克隆过程中形成二级结构，抑制PCR扩增过程。

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