在生物医药研发的浪潮中，重组蛋白作为核心生物试剂，其高效表达始终是科研与产业化的关键瓶颈。原核系统（尤其是大肠杆菌）以其成本低、周期短、操作便捷的优势成为首选平台。然而，在追求高产量、高活性、可溶性蛋白的道路上，科研人员常常遭遇一系列技术“拦路虎”。本文将梳理原核蛋白表达中的常见难题，并阐述泓迅生物如何通过AI密码子优化技术提供高效解决方案。

1. 原核表达系统的概述

在原核生物中，外源基因被克隆到一个表达载体上，并被转化到宿主细胞内。表达载体包含了启动子、起始密码子、编码区、终止密码子和终止子等序列元素，它们一起协作使得外源基因能够在宿主细胞内被翻译出来。可以构建人工载体，并将它们导入大肠杆菌等被广泛研究的细菌中，以制备重组蛋白。

优势&局限：

该系统具有高表达水平、简单易操作、表达后产物不含糖基化修饰等优势。同时，原核生物的生长速度也非常快，从而可以大规模制备蛋白。但是原核生物无法进行复杂的翻译修饰，因此不能用于表达需要糖基化或者复杂修饰的蛋白。

应用范围：

原核表达系统可以用于表达许多不需特殊修饰的蛋白，如细胞生长因子、抗原、重组蛋白等，被广泛应用于蛋白纯化、分子免疫学、结构生物学等领域。同时，它也是研究新型药物的重要平台。

2. 原核重组蛋白表达“痛点”解析

设计阶段核心问题

信号肽残留是新手常见的设计失误：真核蛋白的信号肽在原核系统中无法识别，其强疏水性易导致蛋白失活或包涵体形成。所以克隆时务必切除信号肽，仅保留成熟蛋白序列。

基因序列设计缺陷同样高频发生：

密码子问题（稀有密码子阻滞翻译、GC含量异常、mRNA二级结构复杂）可通过密码子优化解决；

酶切位点选择不当（如NcoI位点致移码）需谨慎设计酶切位点位置；

蛋白特性忽视（<10 kDa小蛋白易降解、>100 kDa大蛋白折叠难、疏水区聚集）需结合促溶标签（如SUMO/MBP）或分段表达策略。

表达阶段的典型问题

蛋白不表达或表达量低

基因序列中的稀有密码子（尤其富含精氨酸Arg、亮氨酸Leu、异亮氨酸Ile、脯氨酸Pro的基因）、复杂的mRNA二级结构阻碍核糖体行进、启动子强度不足、宿主菌株的tRNA库不匹配。

蛋白形成包涵体

重组蛋白在胞内高浓度快速表达时折叠错误、分子伴侣辅助不足、疏水区域暴露导致不可溶性聚集。

•  蛋白降解

宿主内源蛋白酶活性高、蛋白自身结构不稳定（特别是N端不稳定氨基酸）、缺乏必要的翻译后修饰保护。

•  纯化困难

宿主杂蛋白多、目的蛋白与分子伴侣或核酸共沉淀、亲和标签（如His-tag）掩蔽或去除效率低、非特异性结合。

•  SDS-PAGE条带异常

意料外的翻译后修饰（虽在原核中较少，但存在）、复性不完全导致聚集或多聚体、蛋白异常电荷分布、降解碎片。

•  宿主菌毒性反应

表达的外源蛋白对宿主细胞具有毒性、诱导剂浓度过高或诱导时间过长。

重组蛋白表达不是一蹴而就的事情，任何一种方案不会适用于所有案例，因此蛋白表达需要不同的应对策略。

3. 破局之钥：密码子优化

密码子优化是解决源头性问题的核心策略之一。泓迅生物作为AI赋能的合成生物学技术领导者，推出了 NG Codon 2.0 AI 密码子优化技术平台，提供专业的基因序列优化服务，改变表达宿主菌株、调整表达条件（如温度、培养基组分等）等方法来提高可溶性蛋白的表达水平。

攻克“低表达/不表达”：

对基因序列进行宿主偏好性密码子优化。彻底消除稀有密码子，替换为大肠杆菌高表达频率的同义密码子，确保tRNA的充足供应和核糖体翻译的流畅性。同时，算法优化mRNA二级结构，最小化可能阻碍翻译起始和延伸的稳定茎环结构，显著提升翻译效率。

缓解“包涵体”形成：

密码子优化不仅解决“有没有”的问题，更关注“快不快”和“好不好”。通过调控密码子的使用偏好，可适度降低特定区域（如富含脯氨酸、精氨酸的区域）的翻译速率，给予新生肽链更充分的折叠时间，减少因翻译速度过快导致的错误折叠和聚集。优化后的序列更易获得正确折叠的可溶性蛋白。

未经密码子优化与密码子优化2.0对比

蛋白R0103，分子量53.48kDa，未优化序列分别构建于pET-28a（+）载体，采用37℃及16℃两种条件进行异源蛋白表达，未优化的序列未见目的蛋白表达，经过泓迅科技NGTMCodon密码子优化2.0在37℃和16℃均有显著目标蛋白表达。

原核重组蛋白表达之路充满挑战，但绝非无解之谜。精准的密码子优化是打通高效表达“任督二脉”的关键起点。

大肠杆菌蛋白表达与纯化平台

泓迅生物的大肠杆菌蛋白表达与纯化平台，充分利用E. coli 的经济高效和稳定性等特点，借助于完备的合成生物学平台和高效的NG Codon 2.0 AI密码子优化技术，为遍布全球的科学家提供毫克至克级高纯度活性蛋白定制服务。

• 成功率＞95%

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