利用大肠杆菌表达系统生产自然结构的双抗

【背景】

双特异性抗体是含有两种特异性抗原结合位点的人工抗体，能在靶细胞和功能分子(细胞)之间架起桥梁，激发具有导向性的免疫反应，是基因工程抗体的一种，在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景。在将两条不同的重链和轻链配对的同时又要保持天然非免疫原抗性的抗体结构，这对双特异性抗体的设计和生产具有巨大的挑战。

本文提出在大肠杆菌中共培养MET-EGFR双特异性抗体的设计及生产的新策略。利用该方法可以快速生成来自任何两种已知抗体的双特异性抗体，并且可以达到毫克至克级别的产量，足以用于广泛的抗体发现和临床前应用。

【方法】

对“半抗体”序列进行设计，并将其克隆至表达载体。将两种不同“半抗体”的质粒在大肠杆菌中进行共培养，相比传统半抗体生产方法，可以减少实验步骤提高生产效率。利用HIC（疏水层析）设备可以基本分离出大肠杆菌中共培养的双特异性蛋白。这一方法类似于在哺乳动物细胞（如CHO细胞）中生产单克隆抗体的标准方法。

【结果】

  1. 在大肠杆菌表达系统中生产具有凹凸结构（knob and hole）的“半抗体”，并在体外利用在“半抗体”上设计的凹凸结构，将其组装成双特异性抗体。
  2. 利用大肠杆菌共培养的方式生产双特异性抗体。SEC和质谱分析结果显示，以60： 40（anti-Met:anti-EGFR）比例共培养的双特异性抗体，与氧化还原法生产的“半抗体”具有相似的单体稳定性和二聚体纯度。
  3. 对MET-EGFR双特异性抗体分别进行体外和体内检测，结果显示该双抗对MET和EGRF通路都有抗性 。

参考文献
Spiess, C., et al., Bispecific antibodies with natural architecture produced by co-culture of bacteria expressing two distinct half-antibodies. Nat Biotechnol,2013. 31(8): p. 753-8.