哺乳动物细胞CRISPR-Cas9的基因编辑

【背景】

FVIII是凝血过程中重要的组成部分,如果FVIII功能缺失则会导致血友病。FVIII分子是异源二聚体,由重链(HCh,A1-A2-B 结构域,分子量:90-210 kDa)和轻链(LCh,A3-C1-C2 结构域,分子量:80 kDa)组成。由于重组FVIII分子表达量低,成为体外表达FVIII分子的一个挑战,先前有报道密码子优化以及B结构域删除的FVIII (BDD-FVIII)cDNA可以增加FVIII分子表达量,且慢病毒系统对于表达FVIII cDNA 非常有效,然而,同义突变可能影响蛋白的结构和功能。

本文通过基因合成的方法优化BDD-FVIII cDNA密码子 并构建至慢病毒载体中,与野生型(WT)FVIII cDNA载体表达的蛋白质表达量以及性质相比,结果显示,经过优化的BDD-FVIII cDNA可以增加蛋白质的表达量,且不影响蛋白质的性质和功能。

【方法】

  1. BDD-FVIII cDNA 研究流程图
  2. BDD-FVIII cDNA 研究流程图

  3. 密码子优化B结构域删除的FVIII (BDD-FVIII)cDNA(CO)及构建至慢病毒载体
  4. 将FVIII cDNA 的B结构域删除,用一个linker序列代替,并在C端增加一个40氨基酸组成tag标签,此标签包括凝血酶和烟草腐蚀病毒肽链内切酶识别位点Strep/10xHis ,此cDNA命名为CO,并将CO构建至慢病毒载体PLNT/SFFV-MCS(图1)。

     BDD-FVIII慢病毒载体结构示意图

  5. CO蛋白表达分析
  6. 通过将CO慢病毒载体多次转导细胞,以增加拷贝数,利用ELISA法对CO蛋白进行定性和定量分析。

  7. CO蛋白的结构和活性分析
  8. 利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、Western-blot(WB)、圆二色光谱技术(CD)等方法对CO蛋白的一级和二级结构进行分析;利用显色分析和表面等离子体共振分析(SPR)方法对CO蛋白的活性进行分析。

 
【结果】

  1. CO蛋白表达分析
  2. 将CO慢病毒载体转导入BHK-M,SK-Hep-1 和CHO 细胞系,但是BHK-M只分泌单条链的SCh,而SK-Hep-1 和CHO可以分泌异源二聚体HCh和LCh,如图2和3所示,所有细胞的CO蛋白的表达量显著高于WT型的表达,高达7倍, xyntha为BDD-FVIII对照组。

    CO蛋白在各细胞系表达分析

    CO蛋白表达量分析

  3. CO蛋白结构和活性分析
  4. 用凝血酶切割分析CO和WT蛋白,结果发现CO和WT蛋白切割的LCh与xyntha的相似(图4)。WT和CO蛋白的氨基酸覆盖99%的BDD-FVIII的序列,并且WT和CO cDNA含有相似的转录后修饰位点(PTM)。

    凝血酶切割分析

    利用原紫外圆二色性(CD)分析CO,WT以及xyntha蛋白的二级结构,每个蛋白在219nm处均存在强的负极值,且Β结构的含量相似,这些结果显示WT和CO蛋白的二级结构相似(图5)。

     圆二色性分析

    假设WT和CO正确的整体结构可以反应FVIII的活性,利用显色分析估计蛋白活性比率,WT和CO蛋白具有相似的结果;蛋白特殊的活性研究结果显示,CO蛋白的活性是WT蛋白活性的1.5倍,见表1。

    FVIII 变体特殊活性分析

    由于B结构域的删除可能与FVIII变体活性的差异分析有关联,因此增加WT和CO蛋白的凝血和凝血酶生成实验,结果显示WT和CO特殊活性相似,该实验结果是基于凝血时间,凝血酶峰高和到达高峰的时间(图6)。

    凝血和凝血酶生成实验

  5. CO蛋白与血管性血友病因子VWF的作用
  6. FVIII有VWF结合延伸点,研究WT、CO及xyntha与VWF的结合方式,以评估WT和CO的结构,结果显示它们的动力学参数相似(图7)。

    FVIII变体与VWF结合实验

 
【结论】

密码子优化的BDD-FVIII蛋白表达量增加,是WT型的7倍,且蛋白质的性质和功能与WT型蛋白相似。

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参考文献
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[2].Shestopal S A, Hao J J, Karnaukhova E, et al. Expression and characterization of a codon-optimized blood coagulation factor VIII[J]. Journal of Thrombosis &
Haemostasis, 2017.