哺乳动物细胞CRISPR-Cas9的基因编辑

【背景】

FVIII是凝血过程中重要的组成部分，如果FVIII功能缺失则会导致血友病。FVIII分子是异源二聚体，由重链（HCh，A1-A2-B 结构域，分子量：90-210 kDa）和轻链（LCh，A3-C1-C2 结构域，分子量：80 kDa）组成。由于重组FVIII分子表达量低，成为体外表达FVIII分子的一个挑战，先前有报道密码子优化以及B结构域删除的FVIII （BDD-FVIII）cDNA可以增加FVIII分子表达量，且慢病毒系统对于表达FVIII cDNA 非常有效，然而，同义突变可能影响蛋白的结构和功能。

本文通过基因合成的方法优化BDD-FVIII cDNA密码子 并构建至慢病毒载体中，与野生型（WT）FVIII cDNA载体表达的蛋白质表达量以及性质相比，结果显示,经过优化的BDD-FVIII cDNA可以增加蛋白质的表达量，且不影响蛋白质的性质和功能。

【方法】

  1. 密码子优化B结构域删除的FVIII （BDD-FVIII）cDNA（CO）及构建至慢病毒载体

    2. 将FVIII cDNA 的B结构域删除，用一个linker序列代替，并在C端增加一个40氨基酸组成tag标签，此标签包括凝血酶和烟草腐蚀病毒肽链内切酶识别位点Strep/10xHis ，此cDNA命名为CO，并将CO构建至慢病毒载体PLNT/SFFV-MCS。

  2. CO蛋白表达分析

    3. 通过将CO慢病毒载体多次转导细胞，以增加拷贝数，利用ELISA法对CO蛋白进行定性和定量分析。

  3. CO蛋白的结构和活性分析

    4. 利用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、Western-blot（WB）、圆二色光谱技术（CD）等方法对CO蛋白的一级和二级结构进行分析；利用显色分析和表面等离子体共振分析（SPR）方法对CO蛋白的活性进行分析。

 
【结果】

  1. CO蛋白表达分析

    2. 将CO慢病毒载体转导入BHK-M，SK-Hep-1 和CHO 细胞系，但是BHK-M只分泌单条链的SCh，而SK-Hep-1 和CHO可以分泌异源二聚体HCh和LCh，如图2和3所示，所有细胞的CO蛋白的表达量显著高于WT型的表达，高达7倍， xyntha为BDD-FVIII对照组。

  2. CO蛋白结构和活性分析

    3. 用凝血酶切割分析CO和WT蛋白，结果发现CO和WT蛋白切割的LCh与xyntha的相似。WT和CO蛋白的氨基酸覆盖99%的BDD-FVIII的序列，并且WT和CO cDNA含有相似的转录后修饰位点（PTM）。

    利用原紫外圆二色性（CD）分析CO，WT以及xyntha蛋白的二级结构，每个蛋白在219nm处均存在强的负极值，且Β结构的含量相似，这些结果显示WT和CO蛋白的二级结构相似。

    假设WT和CO正确的整体结构可以反应FVIII的活性，利用显色分析估计蛋白活性比率，WT和CO蛋白具有相似的结果；蛋白特殊的活性研究结果显示，CO蛋白的活性是WT蛋白活性的1.5倍。

    由于B结构域的删除可能与FVIII变体活性的差异分析有关联，因此增加WT和CO蛋白的凝血和凝血酶生成实验，结果显示WT和CO特殊活性相似，该实验结果是基于凝血时间，凝血酶峰高和到达高峰的时间。

  3. CO蛋白与血管性血友病因子VWF的作用

    4. FVIII有VWF结合延伸点，研究WT、CO及xyntha与VWF的结合方式，以评估WT和CO的结构，结果显示它们的动力学参数相似。

 
【结论】

密码子优化的BDD-FVIII蛋白表达量增加，是WT型的7倍，且蛋白质的性质和功能与WT型蛋白相似。

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参考文献
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[2].Shestopal S A, Hao J J, Karnaukhova E, et al. Expression and characterization of a codon-optimized blood coagulation factor VIII[J]. Journal of Thrombosis &
Haemostasis, 2017.