基于miRNA策略降低获得性流感功能研究中的风险

【背景】

在1997年,H5N1病毒引起了数百人的死亡。尽管H5N1发病率和死亡率较高,但是迄今为止,仅在鸟类中传播。血细胞凝集素蛋白(HA)中三个氨基酸突变就会导致H5N1 A型流感病毒在雪貂间进行传播,鸟类H5N1病毒会发生天然的重组,这可能引起获得性流感的风险,导致哺乳动物之间发生A型流感病毒的传播。

在过去的研究中发现,microRNA(miRNA)结合位点整合到A型流感病毒基因中能够抑制病毒基因的表达及其传播。本实验发现了一个特殊的miRNA-192结合位点,miR-192在人类呼吸道上皮细胞和小鼠的肺细胞中表达,但是在雪貂中不表达,因此将miR-192结合位点整合到A型流感病毒基因中,病毒不会改变在雪貂体内的复制和传播功能,但是会减弱在小鼠中的致病性。这种分子生物安全保障方法能够减弱A型流感病毒及其他种类病毒给人类带来的风险。

【方法】

  1. 已知雪貂常用于A型流感病毒的传播实验,MDCK细胞常用于A型流感病毒的生长培养实验。对人类和雪貂的肺细胞以及狗肾细胞(MCDK)进行RNA测序,筛选在雪貂肺细胞和MCDK细胞中不表达,但是在人类A549细胞中表达的miRNA分子。
  2. 将miR-192靶位点插入到HA中(图1)。为了确认miR-192是否会对A型流感病毒具有一定的抑制作用,使用3种A型流感病毒分别感染表达miR-192的MDCK192和人A549细胞以及不表达miR-192的MDCK细胞,并绘制了多重生长曲线。3种A型流感病毒为:野生型(WT )A型流感病毒、表达多种RNA的ctrl A型流感病毒以及含有miR-192 靶位点的A型流感病毒。
  3. 将miR192位点插入到不同病毒的HA基因中

  4. 为了确定含有miR-192 靶位点的A型流感病毒在小鼠完整肺部系统中的作用,用WT、ctrl和192t病毒分别感染C57BL/6小鼠。

【结果】

  1. 根据测序结果筛选出miR-138、 miR-193b和 miR-192三个可能沉默A型流感病毒的miRNA。其中miR-138 和miR-192具有“分子生物控制潜能”,而miR-193b在雪貂肺中大量表达。miR-192在人类下呼吸道支气管和肺泡中大量表达,并且能够抑制A型流感病毒。因此miR192可作为一个潜在沉默A型流感病毒在人和小鼠细胞中表达的miRNA。
  2. NGS测序每种RNA占总miRNA的百分比

  3. 在MDCK细胞中WT、Ctrl和192t病毒的HA蛋白含量与NP含量基本一致,但是在MDCK192和A549细胞中WT、Ctr l A型流感病毒的HA蛋白含量不受影响,而192t A型流感病毒的HA无表达(图3)。这说明MDCK192和A549细胞中表达的miR192与192t病毒的miR192靶位点结合,使miR192在细胞中发挥作用,降低细胞中HA基因的表达量。
  4. 三种病毒的HA基因在三种细胞中的表达量

  5. 用WT和ctrl病毒感染的MDCK 细胞血凝素和核蛋白表达量基本相同,但是192t病毒感染的MDCK192细胞血凝素和核蛋白表达量显著下降(图4) 。
  6. 图4. MDCK 和MDCK192细胞中A型流感病毒复制动力学描述

  7. 感染含有miR-192 靶位点的A型流感病毒小鼠无发病迹象也无死亡现象,即使增加一个数量级的病毒仍然无小鼠死亡现象;而感染WT和ctrl A型流感病毒的小鼠体重减轻,并在感染病毒的8天内全部死亡(图5) 。因此可以说明miR-192表达可以降低A型流感病毒感染及降低诱发疾病的风险。
  8. 小鼠感染病毒死亡率

参考文献
Langlois, R.A., et al., MicroRNA-based strategy to mitigate the risk of gain-of-function influenza studies. Nat Biotechnol, 2013. 31(9): p. 844-7.