高覆盖率的shRNA筛选证实TMEM129是参与内质网关联蛋白降解的E3连接酶

【背景】

错误折叠蛋白质反转移进入细胞质后通过泛素蛋白酶系统降解,这个降解过程称为内质网关联蛋白降解(ERAD)。人类巨细胞病毒蛋白质US11利用ERAD通路下调内源性抗原递呈分子(HLA I类分子)在病毒感染细胞中的表达,从而躲避被细胞毒性T淋巴细胞消除。US11介导的HLA I类分子降解有助于证实哺乳动物ERAD通路由哪些关键基因组成。

RNAi技术的发展和应用极大地推动哺乳动物基因功能研究。沉默非转染细胞系可以通过慢病毒载体将shRNA整合到基因组上,结合深度测序分析,实现可控的、大规模的多重筛选。本文构建了一个高复杂的新shRNA文库,靶向所有已知的人类蛋白质编码基因,随后进行全基因组筛选以确定与US11介导的HLA I 类分子降解相关的必需的新蛋白质。研究发现TMEM129是参与内质网关联蛋白降解的E3连接酶。

【方法】

  1. 构建shRNA library
  2. 构建shRNA library,采用芯片合成含shRNA序列的引物,通过引物PBS-1和PBS-2扩增shRNA DNA片段,将DNA片段构建至慢病毒载体中。

  3. 构建HLA-A2-eGFP 慢病毒载体和US11慢病毒载体
  4. 利用基因合成技术合成HLA-A2-eGFP和US11基因,或扩增HLA-A2-eGFP和US11 cDNA,将DNA片段构建至慢病毒载体中。

  5. 处理U937细胞
  6. 用HLA-A2-eGFP慢病毒载体侵染U937细胞,筛选有绿色荧光的细胞侵染US11慢病毒载体。

  7. 全基因组shRNA 筛选
  8. 用shRNA library侵染上步处理的U937细胞。

  9. 细胞筛选和免疫共沉淀
  10. 通过绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白区分不同类型的细胞,通过免疫共沉淀检测基因表达上调或下调情况。

  11. CRISPR/Cas9敲除TMEM129

shRNA文库研究流程图

 
【结果】

  1. shRNA筛选确定TMEM129参与HLA-I ERAD通路
  2. shRNA library侵染细胞后 ,绿色荧光细胞与无荧光细胞对比,shRNA含量增加的基因包括TMEM129,从而确定TMEM129是 HLA-I ERAD通路中的一员,如表1。

  3. TMEM129 是US11 介导HLA‒I降解的关键
  4. TMEM129 shRNA作用于U973 eGFP ‒Myc-HLA-A2 US11细胞后,发现绿色荧光细胞增多(a),并且eGFP ‒Myc-HLA-A2蛋白量同时增加(b),TMEM129蛋白大部分被抑制(d);当经过TMEM129 cDNA 补救后,绿色荧光细胞又减少了(c)。
    利用CRISPR-Cas9将TMEM129敲除,可以发现绿色荧光细胞增多,当再经过TMEM129 cDNA 补救后,绿色荧光细胞又减少了(e)。随后,增加实验确定TMEM129损坏HLA-I HC,从而使HLA-I HC被降解(f)。在蛋白酶体抑制作用下,我们观察到对照组细胞中去糖基化的HC的积累,而这些物质在用于TMEM129的细胞中完全不存在,结果如图g。
    综上,TMEM129 是US11 介导的HLA ‒I降解关键。

    shrna

    shrna-1

    shrna-2

  5. TMEM129是E3泛素连接酶
  6. TMEM129位于内质网,其含有C4C4 RING(h),表明TMEM129是E3泛素连接酶。

    TMEM129

    TMEM129-1

 

参考文献:
Bassik, M. C. et al. Rapid creation and quantitative monitoring of high coverage shRNA libraries. Nat. Methods 6, 443–445 (2009).