Conjugate-SELEX高通量筛选方法靶向细胞内抗癌药的递送

【背景】

目前，对于纳米医学治疗来说，如何向恶性肿瘤靶向递送不同载荷量的药物和显像探针仍然是一个严峻的挑战。因此，建立癌症靶标药物递送平台，准确地将抗癌药物递送到癌症细胞中，减少抗癌药物对非靶标细胞的毒性伤害是纳米医学治疗的重要发展方向。在过去的研究中，研究人员成功的使用小分子和抗体来递送药物，但是具有一定的限制性。而在临床医疗中，核酸适配体可以作为抗体和小分子药物的有效替代物。核酸适配体是短的单链寡核苷酸分子，具有高特异性和高亲和性能够折叠成三维结构并靶向目标分子。与抗体相比，核酸适配体具有无免疫性的优势，可以使用化学方法轻松合成，并且每一批次核酸适配体之间差异较小。核酸适配体文库的库容通常为1014左右，远大于传统的小分子文库，因此更容易找到特异性较高的核酸适配体。

本文计划筛选出可与头颈部鳞状细胞癌细胞（HNSCC）靶定的TA-LNP，通过构建“Conjugate-SELEX”筛选平台，进行Aptamer-LNP文库筛选，得到的核酸适配体能靶定细胞表面的目标蛋白并内化到细胞中，向细胞内传递药物。

【方法】

Conjugate-SELEX”筛选平台

  1. 固定比例的核酸适配体结合LNP：10个核酸适配体（TAs）结合一个LNP（LNP是脂质体纳米粒，有助于核酸适配体内化进入目的细胞中）；
  2. 将TA从细胞中提取出来并进行扩增，用于构建结合LNP的亚文库，并进行下轮筛选；
  3. 在TA-LNP进入胞质进行阴性筛选实验，排除非特异结合的竞争，识别出有效荷载进入目标细胞的TA，减少非目标细胞的吸收；
  4. 将LNP进行荧光标记，对每轮成功进入细胞的LNP荷载进行统计（图1）。

Conjugate-SELEX筛选平台流程图

【结论】

  1. 内化TA-LNP文库的选择

    2. 高通量测序结果显示，经过10轮筛选后，富集到了丰富度最高的10条核酸适配体序列。经过Conjugate-SELEX 的阴性筛选，一些序列消失，而另外一些序列的相对丰度稳定增加（图2）。阴性筛选过程得到的核酸适配体序列与目标细胞的亲和力较强。

    扩增序列的测序结果

    对Conjugate-SELEX循环筛选过程中出现频次最高的14条序列构建了进化树，发现14条序列可以分成2个家族，每个家族内只有1个碱基不同（图3）。

    扩增序列进化树

  2. TA-seq#1的目标识别

    3. TA-seq#1在Conjugate-SELEX过程中扩增倍数最大，并可以高效地内化进入UM-SCC-2A细胞中，因此选择TA-seq#1进行深入的功能研究。根据不同的丰富度和特异性将存在于癌细胞表面的AHNAK蛋白选为与TA-seq#1结合并介导其进入癌细胞的蛋白。免疫组织化学分析显示，AHNAK在人和小鼠不同器官的癌细胞中的表达量有所不同，在大部分的癌细胞中，AHNAK的表达量较高，但是在鼠的卵巢癌细胞（MOSEC）中表达量最低（图4和5）。

    表达情况

    在MOSEC细胞中表达量最低

  3. TA-LNP-#1进入细胞的情况

    4. 为了测定AHNAK蛋白对TA-LNP-#1进入癌细胞（AHNAK蛋白在UM-SCC-22A细胞中高表达，在MOSEC细胞中低表达）内部的影响，设置了抑制AHNAK蛋白表达的R4-LNP为对照组。经过免疫组织化学方法测定得知，TA-LNP-#1进入UM-SCC-22A细胞中的数量是MOSEC细胞中的2.5~4倍，而对照组之间则无显著性差异（图6和7），由此可以得知AHNAK蛋白对TA-LNP-#1进入癌细胞具有重要作用。

    TA-LNP-#1进入细胞的情况

    TA-LNP-#1及R4-LNP进入细胞的定量分析

  4. 使用TA-LNP-#1递送阿霉素并检测对UM-SCC-22A细胞的影响

    5. 实验结果显示，与只有LNP的对照组相比，使用TA-LNP-#1递送阿霉素杀死UM-SCC-22A细胞效率更高，IC50下降显著（图8）。

    UM-SCC-22A细胞IC50下降

参考文献

Mu, Q., et al., Conjugate-SELEX: A High-throughput Screening of Thioaptamer-liposomal Nanoparticle Conjugates for Targeted Intracellular Delivery of Anticancer Drugs. Mol Ther Nucleic Acids, 2016. 5(10): p. e382.