合成染色体臂在酵母体内的功能和表型多样性研究

【背景】

酿酒酵母是首个被全基因组测序的真核生物。国际科学界发起的酿酒酵母基因组合成计划(Sc2.0),旨在重新设计并化学再造完整的酿酒酵母染色体。Boeke 实验室以寡核苷酸链为起始,从头合成酿酒酵母基因组。设计合成的 IX 号染色体右臂(synIXR) 与 VI 号染色体部分左臂 (semi-synVIL),期望其在酵母细胞中能够发挥功能。本文引入可诱导的SCRaMble系统,可以在酵母人工染色体中有效生成随机突变组合,产生复杂的基因型和表型。

【方法】

  1. 在天然野生的染色体臂IXR基础上设计构建人工合成的染色体右臂synIXR:通过着丝粒延伸开放阅读架序列,去除tRNA基因、Ty1长末端重复序列和端粒序列,并插入43个loxPsym位点为下游诱导SCRaMble系统重排基因组提供底物。
    以类似的方法设计合成VI染色体左臂端粒片段中的30kb (semi-synVIL)。
  2. synIXR和semi-synVIL的基因排列图

  3. 通过细菌人造染色体载体克隆synIXR,利用Sanger测序检测序列复制的准确性。
  4. 通过转化将synIXR引入二倍体菌株中,向符合PCRTag测试的转化子中引入含有标记基因的线性DNA片段来截断野生IXR的同源染色体,形成IX△R。利用孢子成活率来分析完整的包含各种未知必须基因的synIXR对菌株存活的影响。
  5. synIXR单倍体的产生

  6. 在不同的生长条件下培养酵母菌株,观察菌落大小和形态学改变,研究synIXR和semi-synVIL对菌株适应性的影响。
  7. SCRaMble系统的应用:质粒pSCW11-Cre-EBD能够在每个细胞周期内产生一次且只有一次重组酶活动。合成的synIXR染色体含有多个loxPsym位点,为Cre高度敏感,当诱导剂雌激素加入时,染色体重组将在最初设计的loxPsym位点发生。
  8. 通过影印平板培养法,分离筛选出由SCRaMble系统重组诱变导致的营养缺陷型菌株。

【结果】

  1. Sanger测序结果表明,合成的synIXR能够在载体中准确复制。
    只含有synIXR和IX△R的细胞缺失许多必要基因,难以存活。
  2. 雌激素诱导的染色体重组,使得synIXR中的必要基因缺失,导致菌株存活率下降,但是对semi-synVIL菌株没有明显影响。
  3. 野生菌株和synIXR菌株在诱导染色体重组时的生长情况

  4. PCRTag分析显示,所有Met-营养缺陷型菌株都有位于loxPsym侧面包含MET28和YAP5的片段缺失,所有Lys-营养缺陷型菌株都有LYS1片段的缺失。许多SCRaMble营养缺陷体是高度多变的,通常有不止一个片段的缺失。
  5. PCRTaG分析

参考文献
Dymond,J.S., Richardson,S.M.,et al. Synthetic chromosome arms function in yeast and generate phenotypic diversity by design. Nature, 2011. 477(7365): p.471-476.