DNA甲基化是重要的表观遗传学标记信息,获得全基因组范围内所有C位点的甲基化水平数据,对表观遗传学的时空特异性研究具有重要意义。全基因组甲基化测序(Whole Genome Bisulfite Sequencing,WGBS)是以新一代高通量测序平台为基础,结合全基因组重亚硫酸盐处理,对有参考基因组的物种在全基因组水平进行高精准甲基化研究。WGBS在基因表达调控、肿瘤研究、染色质重塑、遗传印记、疾病研究、胚胎发育、环境与表观遗传和表观异质性等方面起重要的作用,是表观遗传学研究的热点。

方案设计

全基因组甲基化实验设计思路为差异比较,常见的类型为实验组与对照组进行两两比较。通过重亚硫酸盐对基因组 DNA 进行处理,将未甲基化的 C 碱基转化为 U 碱基,而甲基化的 C 则不会改变,进行 PCR扩增后 U 碱基会变成 T,与原本具有甲基化修饰的 C 碱基区分开来。 WGBS 精密度高,可以得到单个碱基,获得单碱基精度生物甲基化图谱。建议设置 3-6 个生物学重复,以减少组内误差并增强结果的可靠性。

技术路线

技术路线

分析内容

    1.     测序数据质量评估
    2.     与参考基因组比对
    3.     甲基化位点检测
    4.     甲基化水平分布
    5.     甲基化密度分布
    6.     甲基化组间比较分析
    7.     相关基因GO分析
    8.     相关基因KEGG分析
    9.     多样本分析

部分分析结果展示
甲基化分布

甲基化分布

KEGG富集分析
KEGG富集分析

案例解析

利用全基因组甲基化测序绘制肿瘤微环境表观遗传特征谱
本研究利用 WGBS 技术,对肿瘤相关成纤维细胞 CAF 和非恶性前列腺成纤维细胞 NPF 进行甲基化检测,筛选两者间的差异甲基化区域 DMR,并进行 DMR 注释。结果显示 CAF 中的 DMR 富集发生于基因调控区域,通过与 RNAseq 的联合分析证明这些 DMR 会对基因的转录产生调控作用。另外 CAF 中 DMR 基因注释结果显示,DMR 富集到与肿瘤相关的信号通路。CAF 中筛选到的这些 DMR 可用于进行前列腺癌的诊断。

甲基化与转录组联合分析显示DMR对DEG的调控关系

甲基化与转录组联合分析显示DMR对DEG的调控关系


参考文献:
Pidsley R, Lawrence MG, Zotenko E, et al. Enduring epigenetic landmarks define the cancer microvironment. Genome Res ,2018.

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