因为构建的极其简单性和极强的可编程性,CRISPR-Cas9基因组编辑系统在遗传学筛选领域的应用越来越广泛,并且有文献报道表明,用CRISPR-Cas9进行基因敲除的筛选结果比RNAi要更加有效和可靠,并且特异性更高[1];而目前,基于CRISPR-Cas9系统的基因敲除筛选研究已经用于多个领域的靶点和基因鉴定,如肿瘤发展[2]、药物耐受[3]、免疫应答[4]、细菌毒素易感性[5]等。

泓迅科技利用本地化的CRISPR-Cas9 sgRNA设计平台,针对每个基因设计10个sgRNA,并制备成CRISPR-Cas9 sgRNA Panel文库,包括的文库形式有质粒、慢病毒、体外转录sgRNA等,可以为肿瘤发展与进化研究、细胞周期信号通路中靶标筛选、细胞信号通路遗传学筛选研究等提供集成化的sgRNA文库产品。

CRISPR-Cas9 sgRNA Panel优势

  1. 聚焦集成化的CRISPR-Cas9 sgRNA Panel设计;
  2. 质粒、慢病毒、体外转录sgRNA等交付形式;
  3. 泓迅科技Syno®3.0高通量基因合成平台提供的最低合成与构建成本。

CRISPR-Cas9 sgRNA Panel文库筛选流程

文库筛选可以分为两种类型:阳性筛选和阴性筛选 ,两种类型均采用与所研究的表型相关的选择方法。慢病毒CRISPR-Cas9 sgRNA 文库的已有的选择机制举例包括:抗癌药物维罗非尼的抗药性靶点筛选、抗腐败梭菌α毒素的靶点筛选、抗6-硫鸟嘌呤核苷酸的靶点筛选。Pooled Panel文库筛选的同时结合二代测序技术可以精确评估那些目标基因会受选择机制的影响。

sgRNA Panel筛选流程

sgRNA Panel筛选流程


筛选类型

区别

阳性/正向筛选

 

-应用文库
-选择机制:大部分细胞死亡或没有成功转入质粒或病毒
-选取存活的细胞
-将存活的细胞进行二代测序
-获取与选择机制相关的基因列表

阴性/反向筛选

 

-应用文库
-在建立对照组的基础上进行二代测序:应用文库,平行测序
-应用选择机制,大部分细胞存活
-将存活的细胞进行二代测序
-对比两组细胞的测序结果
-得到因为增加选择机制而消失的sgRNAs列表


人类蛋白激酶sgRNA Panel文库

泓迅科技可以针对人类蛋白激酶基因提供sgRNA Panel文库,筛选出对细胞通路、细胞周期和细胞信号转导过程具有调控作用的基因。从催化结构域的序列同源性分析角度看,超过92%的人类蛋白激酶可以归为一个庞大的蛋白超家族,这其中又可以分为大致9个家族,包括:

蛋白激酶分类 举例
AGC蛋白激酶家族 PKA、PKC和PKG等,详细列表请点击查询
CAMK蛋白激酶家族 钙离子依赖的和钙调蛋白依赖的蛋白激酶,详细列表请点击查询
CK1蛋白酶家族 酪蛋白激酶1等,详细列表请点击查询
CMGC蛋白激酶家族 CDK、MAPK、GSK3和CLK等蛋白激酶,详细列表请点击查询
STE蛋白激酶家族 与酵母Sterile7/11/20蛋白激酶的同源类似物激酶等,详细列表请点击查询
TK蛋白激酶家族 包含酪氨酸蛋白激酶等,详细列表请点击查询
TKL蛋白激酶家族 类酪氨酸蛋白激酶等,详细列表请点击查询
非典型蛋白酶家族 包含了ADCK、Brd蛋白激酶等,详细列表请点击查询
其他蛋白激酶家族 包含了NEK、Wnk等蛋白激酶,详细列表请点击查询

 

参考文献:

1.Sanjana, N.E. (2016). Genome-scale CRISPR pooled screens. Anal. Biochem. Published online June 1, 2016. http://dx.doi.org/10.1016/j.ab.2016.05.014.
2. Shalem, O., Sanjana, N.E., Hartenian, E., Shi, X., Scott, D.A., Mikkelsen, T.S., Heckl, D., Ebert, B.L., Root, D.E., Doench, J.G., and Zhang, F. (2014). Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science 343, 84–87.
3. Shalem, O., Sanjana, N.E., and Zhang, F. (2015). High-throughput functional genomics using CRISPR-Cas9. Nat. Rev. Genet. 16, 299–311.
4. Parnas, O., Jovanovic, M., Eisenhaure, T.M., Herbst, R.H., Dixit, A., Ye, C.J., Przybylski, D., Platt, R.J., Tirosh, I., Sanjana, N.E., et al. (2015). A Genome-wide CRISPR Screen in Primary Immune Cells to Dissect Regulatory Net-works. Cell 162, 675–686.
5. Zhou, Y., Zhu, S., Cai, C., Yuan, P., Li, C., Huang, Y., and Wei, W. (2014). High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature 509, 487–491.