基因治疗指的是通过外源导入的方法，对靶细胞中需要治疗和编辑的DNA进行靶向改造，达到治疗基因缺陷等疾病的目的。广义地说，就是对DNA水平的操作治疗，那么，从从更小范围来讲，就是将外源基因通过基因转移技术将其插入病人的适当的受体细胞中，使外源基因导致的某种结果能治疗某种疾病，当然就操作策略讲有破坏致病基因的表达或者修复原来有缺陷的基因等等手段。
那么，免疫治疗呢，讲的是对有机体自身免疫不能完成的任务通过其他手段来完成，有一些疾病和病毒能够逃有机体免疫系统的检查，从而对有机体造成危害，比如一些肿瘤，艾滋病毒等。CRISPR技术作为最新的一代基因编辑技术，对发展略显缓慢的几乎束之高阁的基因治疗和免疫治疗有了非常大的推动，其靶位点分布密集，较高的编辑效率以及较短的实验周期，好越来越被证明的安全性都是基因治疗和免疫治疗中的要害，下面我们简单看一下基因治疗和免疫治疗的近期研究案例。
武汉同济医院2016年11月宣布，成功通过基因治疗方法修复了青少年双盲症患者的视力，这是一种线粒体遗传病，或者由于线粒体DNA突变导致。研究团队用安全病毒载体将正确表达的基因注射到患者眼部，代替不正常功能的基因产物，修复了患者的视力。
美国斯坦福大学的研究团队2016年11月在《自然》杂志上报道了CRISPR技术修复人造血干细胞中导致镰刀型血细胞致病基因的研究，研究者一直致力于基因治疗镰刀形血细胞病，之前的研究中已经尝试了其他早期的基因编辑工具，花了六年时间，现在用数周的时间已经足矣。
《细胞 》杂志近期也报道了科学家利用CRISPR/Cas9基因编辑系统，在人体免疫T细胞内对45个与HIV入侵宿主相关的基因进行特殊编辑分析，甄别出了其中某些基因经编辑改造发生突变后，可保护T细胞免受HIV病毒的侵入、整合、转染的研究报告。这对于令人谈虎色变的艾滋病的预防和治愈有重要意义。CRISPR技术相关的研究近年来成井喷趋势足见其热度，原因恐怕还是CRISPR技术强大的能力可以延伸到各个领域，让不同的研究者获得新的灵感和思路。下面我就为大家带来三篇近期的CRISPR技术在基因治疗和免疫治疗方面的科学论文的解读，分别关于应用CRISPR技术抑制导致艾滋病的HIV病毒和导致乙肝的HBV病毒的研究，以及前面提到过的修复镰刀形血细胞病的研究。
现在我们进入第一篇详解的文献，关于CRISPR系统在HIV治疗中的探索。HIV作为导致艾滋病的病毒对人伤害极大，它能够攻击人体免疫系统，把人体免疫系统中最重要的CD4T淋巴细胞作为主要攻击目标，大量破坏该细胞，使人体丧失免疫功能，人会因为机体抵抗力极度下降会出现多种感染，如带状疱疹、口腔霉菌感染、肺结核，特殊病原微生物引起的肠炎、肺炎、脑炎，念珠菌、肺孢子虫等多种病原体引起的严重感染等，后期常常发生恶性肿瘤，并发生长期消耗，以至全身衰竭而死亡。虽然全世界众多医学研究人员付出了巨大的努力，但至今尚未研制出根治艾滋病的特效药物，也还没有可用于预防的有效疫苗。CRISPR技术的快速发展也体现在HIV的治疗研究中，我们第一篇解读的文献就是关于CRISPR/Cas9系统应用于人细胞内防御HIV-1型病毒，发表在《自然通讯》杂志上，影响因子11分。在解读前我先总结一下这篇研究论文的研究策略，以方便下面的讲解。这项研究中围绕HIV病毒的生命周期的不同阶段，即整合前和后，以及CRSIPR系统中gRNA序列特异靶位点选择与组合，不同的抵御策略即短期的瞬时转化和长期的将CRISPR系统整合在宿主基因组上，三个方面开展试验。
文献解读：CRISPR系统在HIV治疗中的应用
HIV-1病毒的生命周期与CRISPR系统防御策略
HIV-1病毒作为一种慢病毒，其生命周期大致如下，完整的病毒颗粒感染宿主细胞，释放其单链的RNA病毒基因组，单链RNA在反转录成双链DNA后进入宿主细胞核并整合到宿主基因组上以逃避宿主免疫系统，潜伏下来成为前病毒，再次过程中利用宿主细胞转录病毒基因组并表达病毒基因，组装后释放。上一页的研究策略中讲到，治疗HIV 的两个阶段就是其生命周期中游离的双链DNA时期，以及整合的前病毒时期，原因大家都很了解，CRISRP系统是针对双链DNA作用的。
gRNA设计与预实验
7个sgRNA靶位点设计：gEGFP-T1~T4 ； gLTR-T1~T3
首先需要设计一个预实验来确认CRISPR/cas9系统是否能识别并造成慢病毒基因组的靶向断裂，用的病毒模型是不具有复制能力的假型慢病毒。这里gRNA设计针对GFP绿色荧光蛋白的编码区和，慢病毒LTR序列设计了7个靶点，在靶点选择上具有两个不同策略，即在功能蛋白基因的编码区和具有其他功能的非编码区设计靶位点。当然，靶位点的选择需要具有唯一性，不能在宿主基因组和病毒基因组的其他位置具有相同的靶点。第一个实验设计中先使用密码子优化过的hCas9和gRNA载体处理HEK293细胞20-24小时，然后用上述的GFP慢病毒载体处理细胞，并观察4天。流式细胞仪检测发现空载gRNA对照组和脱靶对照组的的荧光阳性细胞百分数和荧光强度相似，而7个靶向gRNA实验组则表现为GFP阳性细胞百分数和荧光强度都下降，根据靶位点的不同，荧光强度减少范围从18%-72%，减少最多的是gEGFP-T1。这里还少不了要做一个对照试验，即只用CRISPR系统中单一的组分即只有Cas9和只有gRNA的条件下的对比，结果应当是与空载对照组结果相同的。
非整合慢病毒试验
上述的实验可以成为一个预实验，初步证明在有效gRNA和Cas9同时存在时，可以抑制慢病毒的表达。前面讲过，慢病毒DNA基因组在细胞中有两种状态，一种是游离的，一种是整合的。第一个试验中CRISPR系统实在那种状态下对病毒作用呢？想确定这个问题就需要再设计实验进行确认。研究者使用了一种非整合型的慢病毒，即这种病毒会在宿主细胞中以游离形式存在，重复第一阶段的实验，看上面两行和左下的实验结果图发现空载gRNA和脱靶gRNA对照组的细胞荧光强度，荧光阳性细胞数都明显的高于靶向gRNA组。这表明CRISPR系统对于游离的非整合病毒基因组具有很好的抑制作用。当然必要的对照试验不能少，右下的图做的是在无其他处理条件下用整合型和非整合型慢病毒处理细胞观察绿色荧光，7天时整合型慢病毒感染的细胞荧光达到最高并维持，而非整合性慢病毒感染的细胞荧光也在7天左右的时间降到低点并维持，这说明非整合型慢病毒感染一段时间后荧光量下降都是CRISPR系统的作用。可能的原因是游离状态的慢病毒被宿主细胞识别并降解了。
整合慢病毒试验
第二阶段的实验确认了CRISPR系统可以抑制非整合状态下的慢病毒表达，下一阶段的实验自然是要探究CRISPR系统对整合状态下慢病毒的作用，这是非常符合科学实验逻辑的，在讲解完这篇文章我们会再回过来说一说科学逻辑的重要性。这一阶段的实验准备了几个可以耐受不同拷贝数慢病毒整合HEK293细胞系，看中间的图B，拷贝数从两个到8个。把CRISPR系统质粒转入这些细胞中，观察细胞荧光的情况。结果发现感染细胞的荧光强度逐渐减少到未感染细胞的程度，看左上图，是转CRISPR系统后14天后的荧光图，下层是DAPI染色的。可以看到空白对照组和脱靶对照组的荧光非常强烈，而靶向组的荧光已经非常少了，从DAPI染色图也可以看出，靶向组的无荧光位置是有细胞的，当然这里放的是第一二阶段中效果最好的EGFP-T1靶向gRNA的图。。这里体现了CRISPR系统可以通过破坏前病毒基因组而达到永久抑制的目的，这与RNAi等临时抑制的策略是完全不同的。测序结果也表明，CRISPR系统对GFP编码区和LTR区域的靶位点造成了插入或者缺失导致了表型上GFP的表达抑制。右上图是全长慢病毒PCR扩增情况，可以发现GFP阴性细胞中的全长病毒基因组也减少了。这表明CRISPR系统可以对整合状态的慢病毒基因组造成插入和缺失的突变，以及全长切除的情况。以gLTR-T2 gRNA组为例，看右下的直方图，qPCR测定脱靶对照的相对拷贝数最高，而处理组中病毒基因组的相对拷贝数大约下降了40%左右，而进一步测定GFP阴性细胞中的病毒拷贝数比对照组下降了80%左右。
整合慢病毒试验
这是在一个月时间范围内的实验图，高低拷贝两个组都有，可以看到空白对照组和脱靶组的细胞荧光强度一直处在较高水平，而实验组的荧光水平随时间都有明显降低。其中有的实验组中使用了双gRNA，这样的实验组的荧光强度都处在非常低的水平。从第十八天开始，对gEGFP-T1组的进行二次处理，二次处理中的空白组和脱靶组的荧光水平基本维持了第18天的水平，而其他有效gRNA组的荧光强度进一步下降。总的来看 一次处理的第七天左右，所有有效gRNA组的荧光水平已经降到低点，随后10天基本维持在这个水平，第二次处理后荧光强度进一步下降。这表明可能存在一个长期的-低剂量的组合治疗方法，在减少对细胞伤害条件下更有效的破坏前病毒基因组。到这里我们再总结一下，对两个阶段即游离病毒和整合病毒，两种靶位点选择即编码区和非编码区作用效果都做过了验证试验，效果还是比较明显的。到这里还没有出现HIV病毒，那下一阶段就要对HIV病毒进行实验。
HIV抗病毒试验
构建假型（HIV-1 nl4-3-Δe-GFP）和野生型（HIV-1 nl43-GFP）HIV病毒
现在HIV病毒正式参与到实验中来，考虑到病毒载体，野生型病毒和类野生型病毒在感染细胞过程中存在差别，首先测试CRISPR系统是否能破坏一般的病毒基因组。根据前面讲到的唯一性的gRNA设计原则，选择在结构蛋白（gag、env），酶（pol）以及毒性基因（vif and rev），以及LTR区设计了众多的gRNA靶点。从上方的这个图中可以看出，构建的两个病毒基因组，野生型的基因组没有破坏任何元件，额外插入一个GFP的转录单元，假型病毒在结构蛋白ENV编码区插入了一个GFP的开放阅读框，并对env造成失活。用靶向gRNA和Cas9处理后发现假型病毒的绿色荧光下降了48%-92%，从下方的图中也可以看出空白对照和脱靶对照组的荧光量没有变化。从图中还可看出，针对LTR区域设计的gRNA导致了更好的抑制效果，尤其是LTR区中的R序列效果最好，在此基础上除了R序列的gRNA，再加一个其他gRNA进行双重抑制，效果较单独的R序列抑制要更好，从右下图中可以看出，配合另一个LTR区的gRNA效果比编码区的gRNA更好。
HIV抗病毒试验
